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1、緊接前作《刺客信條：兄弟會》，現代刺客戴斯蒙·邁爾斯與同伴露西·斯蒂爾曼、肖恩·海斯汀及麗貝卡·克琳已在朱諾神殿尋得“第一文明”古代遺物“伊甸碎片”，而戴斯蒙于刺死露西后陷入昏迷狀態并被送返基因記憶追溯機器“Animus 2.0”以免精神崩潰。

2、于安全模式“黑房”中，戴斯蒙遇上第十六實驗體之意識，獲告悉必須進入其兩名刺客祖先阿泰爾·伊本·拉哈德以及艾吉奧·奧迪托雷·達·佛羅倫薩仍未讀取的記憶，使Animus 2.0能把三人的記憶分開，重組其意識從而蘇醒。

3、于黑房中，戴斯蒙除探索記憶也回憶自己的過去：從小在森林接受各項刺客訓練，但在渴望自由下于十六歲逃走，乘坐便車到達紐約后以酒保為業，最終被跨國制藥公司Abstergo尋獲和脅逼成為Animus實驗體，至此始后悔沒有重視刺客的訓練和承認自己乃一名刺客。

4、1511年3月，52歲的伊吉歐為了解刺客組織及目的而前往三百多年前刺客組織根據地－敘利亞城市馬西亞夫，發現當年作為刺客基地的堡壘已被宿敵圣殿騎士團占領，并獲悉阿泰爾在堡壘地底一密室內藏了一件遺物，其力量能夠永久結束刺客與圣殿騎士團之間的戰爭。

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